VECTORES

1. Plasmídeos
2. Fagos
3. Cosmídeos
4. Fagemídeos
5. Outros vectores

6. Vectores utilizados na construção de uma biblioteca genómica
7. Vectores utilizados na construção de uma biblioteca de cDNA



Os vectores de clonagem molecular são moléculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cópias, a informação genética que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vectores possuindo cada um particularidades que lhe são próprias.


PLASMÍDEOS

Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que confere resistência a um antibiótico. Podem estar presentes em duas ou mais cópias na célula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este plasmídeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, são utilizados como vectores de clonagem. Para isso, têm que possuir certas propriedades:

*  ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA que permite a replicação do vector na célula hospedeira;

*  possuir Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), ou seja, vários locais únicos de clivagem para endonucleases de restrição, os quais constituem o sítio de inserção no vector de clonagem;

*  conter um gene que codifique uma substância que possa distinguir uma célula transformada de uma não transformada. Muitas vezes, são utilizados genes que conferem resistência a um antibiótico, destacando-se, devido à sua grande utilização, o gene que confere resistência à ampicilina. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com ampicilina, enquanto que as restantes não sobrevivem.


▲ Figura D1: Plasmídeo. Plasmídeo com sequências que conferem resistência à ampicilina e tetraciclina. Apresenta ainda uma origem de replicação (ori) e sítios de restrição para a EcoRI, SalI e PstI. Fonte: Passarge, Color Atlas of Genetics; página 57.

Estes vectores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessária a actuação das enzimas de restrição para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vector, através da produção de extremidades coesivas  complementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molécula híbrida resultante é inserida numa célula hospedeira, muitas vezes bactérias, por um processo denominado transformação. O vector pode assim sofrer replicações e proceder à consequente amplificação do número de cópias. Como foi referido anteriormente, estas células são identificadas devido a novas características concedidas pelo plasmídeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um dado antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência).


▲ Figura D2: Clonagem em plasmídeos.
Um plasmídeo é uma pequena molécula circular que contém uma origem de replicação (ori), gene que confere resistência a um antibiótico (no exemplo ampicilina, Amp) e sítio(s) de restrição (no exemplo, sítio de restrição para a EcoRI), o qual pode ser usado para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido é ligado ao vector e os plasmídeos recombinantes são transformados em bactérias, tais como a E. coli. As bactérias são plaqueadas em meios contendo o antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência, como forma de seleccionar as bactérias resistentes (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se então colónias de bactérias com o plasmídeo recombinante. Fonte: Cooper, G.M. and Hausman, R.E. 2003. The Cell: A Molecular Approach. 3d ed. Amer. Soc. Microbiol., Washington and Sinauer Assoc., Sunderland, MA. página 110.

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FAGOS

O fago mais utilizado na clonagem molecular é o
bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli. É assim, uma partícula viral constituída por proteínas e DNA em igual quantidade, e que se apresenta como uma molécula linear de cadeia dupla (cerca de 48.500 pares de bases). É injectado na célula hospedeira por possuir a particularidade das suas extremidades (sítio cos) serem de cadeia simples, constituídas por cerca de 12 nucleótidos que, sendo complementares na sequência de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma circular antes da sua inserção. O genoma do fago λ codifica para 50 proteínas, aproximadamente.


▲ Figura D3: Clonagem em bacteriófagos λ. O vector contém um sítio de restrição (por exemplo, para EcoRI) para inserção do DNA clonado. Adicionalmente, sítios cos, necessários para o empacotamento do DNA nos fagos, estão presentes em ambas as extremidades do vector de DNA. O DNA inserido é ligado ao vector e as moléculas recombinantes são empacotadas nos fagos. Os fagos recombinantes são então usados para infectar bactérias, tais como a E. coli. Cada fago recombinante, que carrega um fragmento único do DNA clonado, forma uma placa única no interior da cultura bacteriana. Fonte: Cooper, G.M. and Hausman, R.E. 2003. The Cell: A Molecular Approach. 3d ed. Amer. Soc. Microbiol., Washington and Sinauer Assoc., Sunderland, MA. página

O fago é usado na clonagem molecular por possuir certas vantagens:

O DNA inserido é empacotado in vitro. A eficiência do empacotamento é somente de 10% aproximadamente, no entanto, uma vez empacotado, a eficiência de inserção na célula E. coli hospedeira é de 100%;

Mais eficiente que a transformação bacteriana com plasmídeos, pois esta na melhor das hipóteses tem 108 transformantes por μg de DNA, o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são transformados.

Existem vários derivados do fago λ, salientando-se os vectores de substituição e os vectores de inserção.

Vectores de substituição: possuem um ou mais locais de restrição na região de recombinação, o que facilita a sua substituição por outro DNA. Como exemplo deste tipo de vector temos o EMBL3, cuja região de recombinação é limitada por enzimas de restrição, nomeadamente a EcoRI, a BamHI e a SalI. Estas, aquando da sua clivagem, podem receber variados fragmentos de DNA entre 10,4 e 20 kb.

Vectores de inserção:
nestes vectores, o DNA a ser inserido não pode ter mais de 7 kb de tamanho, para não ocorrerem alterações nos processos de empacotamento do genoma do fago.

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COSMÍDEOS


O aparecimento da clonagem em cosmídeos deu-se para ultrapassar algumas limitações da clonagem em fagos e
plasmídeos. No fago λ, os fragmentos de DNA a serem inseridos não podem ultrapassar os 15 kb, e, apesar de, por vezes, ser o suficiente para conter um gene completo com as suas sequências limitadoras, na maior parte das vezes, os genes são de maiores dimensões (35 a 40 kb) o que torna impossível a sua inserção.
Os cosmídeos são assim, plasmídeos (com origem de replicação e genes que conferem resistência a antibióticos), que contêm um fragmento de DNA do fago λ incluindo o local cos. São utilizados como veículos de clonagem molecular através do empacotamento in vitro (técnica já referida na clonagem em fagos, que, neste caso, reconstitui a estrutura do fago em cabeça e cauda, sendo assim utilizado para infectar a célula hospedeira). As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distância de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passíveis de serem empacotados. Assim, o DNA é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes fragmentos de DNA que se vão ligar ao cosmídeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante. Numa situação ideal, cada fragmento de DNA genómico possui um local cos nas suas extremidades que, durante o empacotamento, vão ser reconhecidos por enzimas (caso estes locais estejam situados a uma distância de 49 kb). Seguidamente, uma vez injectado no interior da célula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmídeo normal, sem exprimir qualquer função do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistência adquirida a um antibiótico específico.



▲ Figura D4: Esquema de clonagem em cosmídeo. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

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FAGEMÍDEOS


Os fagemídeos foram desenvolvidos de modo a juntar as vantagens do fago e do
plasmídeo. São particularmente úteis na clonagem de cDNA e apresentam algumas características principais:

Apresentam uma zona versátil de múltiplos locais de clonagem (MSC), o que permite a clonagem de genes grandes, sem muita dificuldade, destacando-se igualmente a ordenação espacial dos sítios de restrição, propriedade interessante no sequenciamento de DNA;

Possuem uma combinação estratégica de sítios de restrição que permitem a obtenção progressiva e controlada de fragmentos, os quais após re-circularização se tornam apropriados para o sequenciamento, facilitando-o.

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OUTROS TIPOS DE VECTORES


Derivados do
bacteriófago P1: permitem a inserção de fragmentos de DNA entre 70 e 100 kb, contendo sequências que deixam as moléculas recombinantes ser empacotadas in vitro em partículas de fago P1, e depois replicadas em plasmídeos em E. coli.

PAC (cromossoma artificial P1): contêm também sequências de bacteriófago P1, mas estas são introduzidas directamente em plasmídeos em E. coli, permitindo a inserção de fragmentos de tamanho compreendido entre 130 e 150 kb.

BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmídeos naturais de E. coli, denominado de factor F. A origem de replicação e as outras sequências do factor F, permitem a sua replicação enquanto plasmídeos estáveis, possuindo inserções de 120-300kb. Devido à sua estabilidade, capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA e facilidade de manuseamento, são agora os vectores de clonagem preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos.

YAC ( cromossoma artificial de levedura): contém origens de replicação de leveduras e outras sequências (centrómeros e telómeros), que permitem a sua replicação como moléculas lineares do tipo cromossómico em células de levedura.


▲ Figura D5: YAC. Os YAC (Yeast Artificial Chromossome) permitem a clonagem de moléculas de DNA relativamente grandes. TEL, CEN e ORI correspondem a telómero, centrómero e origem de replicação, respectivamente, para a levedura Saccharomyces cerevisiae. BamHI e EcoRI correspondem a sítios de restrição para as respectivas enzimas de restrição. As sequências A e B codificam enzimas que servem como marcadores de selecção, permitindo um fácil isolamento das leveduras que apresentarem o cromossoma artificial. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 502.

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VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÓMICA                       

Actualmente, os vectores mais utilizados na construção de bibliotecas genómicas são fagos λ e cosmídeos. Em ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentação aleatória, ligam-se ao DNA do vector para poderem ser empacotados em partículas de fago λ.

As bibliotecas construídas com vectores λ são armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes vectores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais. O fragmento ou braço esquerdo, codifica as proteínas da cápsula, e o braço (fragmento) direito, tem a origem de replicação do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braços estão os sítios de restrição usados na clonagem, orientados inversamente – SalI, BamHI, EcoRI –. A extremidade de cada braço apresenta um segmento de cadeia simples (cos). Estes segmentos são complementares entre si, permitindo assim a recircularização da molécula e consequente replicação do fago dentro da célula hospedeira.


▲ Figura D6: Estrutura do vector λ EMBL3. S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

Este tipo de vector é chamado vector de substituição porque, no processo de clonagem, a parte central do DNA do fago é substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando deste modo a molécula recombinante. Os fragmentos clonados são ligados aos braços do fago, previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura empacotada in vitro em partículas víricas. Para se seleccionar apenas os fagos recombinantes, estes são infectados numa bactéria lisogénica. A suspensão de fagos resultante pode ser armazenada durante vários anos num frigorífico, com algumas gotas de clorofórmio para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentração do número de partículas infecciosas vá baixando gradualmente. A biblioteca também pode ser armazenada por congelamento da mistura de ligação (fragmento de DNA/vector).

Na clonagem em cosmídeos, as partículas virais servem apenas como veículos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactéria e uma vez dentro dela o cosmídeo comporta-se como um plasmídeo grande. Os cosmídeos podem aceitar inserções de cerca de 45 kb, quase 2 vezes o tamanho das inserções clonáveis num fago λ. Assim, quando um cosmídeo é utilizado como vector, apenas são necessários 350.000 recombinantes para se atingir 99% de probabilidade de uma sequência de cópia única estar presente numa biblioteca genómica de mamífero.

No entanto, as bibliotecas de cosmídeos são mais difíceis de construir e de manter que as bibliotecas de fagos. Assim, os cosmídeos são utilizados quando o gene de interesse é muito grande ou quando se deseja uma região extensa de DNA; o uso de vectores λ é mais recomendado no isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstâncias em que a biblioteca vai ser utilizada muitas vezes.

O método utilizado para isolamento de clones genómicos específicos tem sido frequentemente o de rastreio por hibridização com uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificação directa de fragmentos de DNA por PCR é agora igualmente comum.

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VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE cDNA


Após ter sido obtido o cDNA, é necessário prepará-lo para ser inserido num vector de clonagem, processo que depende do vector escolhido: plasmídeo ou fago.

* O fago é mais utilizado devido à sua elevada eficiência: comparativamente com os plasmídeos, requer cerca de 16 vezes menos cDNA por μg do vector para produzir um número equivalente de clones recombinantes;

*
As bibliotecas de
fagos são mais fáceis de manipular que as bibliotecas de plasmídeos;

*
No entanto, os
fagos não são favoráveis para procedimentos de sequenciamento de DNA e de mutagénese dirigida.

Para ultrapassar esta limitação idealizaram-se os fagemídeos que são plasmídeos contendo porções do genoma do fago, reunindo assim as vantagens dos dois vectores.

Para efectuar a ligação entre o vector e o cDNA são necessários alguns procedimentos preparatórios, como por exemplo polir as extremidades das moléculas de cDNA de cadeia dupla com a enzima Klenow, de maneira a ficarem blunt e ligadas a locais blunt de vectores de clonagem.
No entanto, este processo não se revela muito eficiente, existindo outros que transformam as extremidades do cDNA em extremidades coesivas, compatíveis com a ligação ao local de clonagem de um vector. Estes processos consistem na adição de adaptadores, sendo o seguinte método um exemplo destes:

1- Metilação dos sítios de EcoRI com o tratamento do cDNA com EcoRI, na presença de S-adenosil metionina. É essencial para proteger os sítios de EcoRI que possam existir no cDNA, contra a digestão da EcoRI, que se vai realizar uns passos à frente;

2-
 Adição de adaptadores, com o sítio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Estes adaptadores são pequenos oligo-nucleotídeos que têm uma extremidade em cadeia dupla, ligando-se às extremidades do cDNA, e têm outra extremidade coesiva, igual à produzida por uma enzima de restrição, permitindo a ligação a um vector preparado com a mesma enzima de restrição. Esta adição de adaptadores resulta na obtenção de moléculas de cDNA com adaptadores múltiplos ligados nas duas pontas;

3-
 Apenas é produzido um sítio de EcoRI em cada ponta do cDNA pela digestão com EcoRI, libertando o excesso de adaptadores ligados na molécula. Não ocorre digestão interna do cDNA devido à metilação previamente efectuada;

4-
 Através da filtração em colunas de Sephadex, o cDNA é separado do excesso de adaptadores, antes de ser inserido no vector;

5-
A T4
ligase permite a ligação das moléculas de cDNA ao vector;

6-
 O produto da ligação junta-se com as proteínas que formam o capsídeo do
fago;

7- Os
fagos assim produzidos vão infectar bactérias de uma linhagem que favoreça o crescimento dos recombinantes;

8-
 A biblioteca é obtida após infecção da bactéria com os cDNA recombinantes, devendo conter cópias de todas as sequências de mRNA da população original.

9- Pode depois ser congelada ou ser submetida a um processo de isolamento do clone de um determinado gene de interesse.

Considerando que as moléculas de cDNA representam o mRNA total de um organismo ou tecido específico -expressão genética – estas bibliotecas são muito úteis para obter genes diferencialmente expressos. Para isso, procede-se ao isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de genes expressos em estádios específicos de desenvolvimento ou em determinadas condições ambientais. Pode-se assim construir bibliotecas através de hibridização subtractiva. Estas bibliotecas são enriquecidas em genes expressos diferentemente em determinadas condições seleccionadas:

*  Obtêm-se preparações de duas populações de mRNA (ligeiramente)diferentes como por exemplo, células do mesmo tipo mas cultivadas a temperaturas diferentes;

*
   A primeira cadeia de cDNA de uma das populações de mRNA é preparada e depois hibridada com um excesso da outra popula­ção de mRNA;

*
   Ocorre a formação de híbridos entre o cDNA e mRNA complementares, respeitantes a genes das duas populações;

*
   A cromatografia em colunas de materiais que ligam especificamente moléculas de cadeia dupla, permitirá a remoção dos híbridos;

*
   O cDNA específico da primeira população per­manece em cadeia simples e não se liga à coluna;

*
   Depois é utilizado para a preparação de uma biblioteca de cDNA enriquecida em determinados genes específicos ou marcado radioactivamente para ser utilizado directamente como sonda, para se proceder ao rastreio de uma biblioteca de genes.

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Links com interesse:
Ver animação "Plasmid Cloning"* (em inglês) (link externo com step-by-step e narração em inglês)

Ver animação "Recombinant DNA"
(em inglês / link externo)


Outros:

Download "Cloning in a plasmid vector.mov" (19MB) (em inglês)



* Necessita QuickTime Plug-In®. Caso não tenha QT® aceda ao link externo.

 

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