Inserção em vectores: DNA Ligase

 

Os fragmentos de DNA podem ser inseridos em vectores, quer possuam extremidades coesivas ou abruptas, com a ajuda de DNA ligases. Estas são usadas para ligar as extremidades coesivas complementares do fragmento de restrição e do vector. O vector e o fragmento de restrição são ligados covalentemente através de ligações fosfodiéster no sentido 3’ → 5’. Além de ligar extremidades coesivas complementares, a DNA ligase do bacteriófago T4 pode ligar também duas extremidades blunt. Esta ligação é, contudo, mais ineficiente e por isso requer maior concentração de DNA e DNA ligase do que ligações para extremidades coesivas.

A DNA ligase isolada de E. coli e de outras bactérias requer NAD+, enquanto que a isolada do bacteriófago T4 requer ATP como cofactor.

 

▲ Figura F3.1: Ligação de fragmentos de restrição com extremidades coesivas complementares. Neste exemplo, o vector de DNA cortado com EcoRI é misturado com uma amostra contendo fragmentos de restrição produzidos por clivagem de DNA com diferentes enzimas de restrição. As curtas sequências de bases que formam as extremidades coesivas são mostradas na figura. A extremidade coesiva do vector (a’) emparelha apenas com a extremidade complementar do fragmento produzido pela EcoRI, (a). Ocorre ligação pela acção catalítica da T4 ligase. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 363.
 

▲ Figura F3.2: Inserção de um fragmento de DNA num plasmídeo com a DNA ligase. Após clivagem com uma enzima de restrição (neste caso uma que produz extremidades coesivas) o fragmento de DNA a ser clonado e previamente preparado com a mesma enzima de restrição é misturado com DNA ligase, produzindo-se uma molécula completa de DNA recombinante. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 501.


▲ Figura F3.3: Construção de uma molécula de DNA recombinante a partir de fragmentos de diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

 


Os plasmídeos recombinantes podem ser inseridos em bactérias por transformação, sendo o DNA inserido replicado como parte do plasmídeo. Geralmente antibióticos são acrescentados ao meio da cultura para seleccionar somente as linhagens que foram transformadas, dado que o processo de transformação tem um rendimento muito baixo. O plasmídeo usado para esta finalidade tem pois que apresentar sequências que lhe confiram resistência a pelo menos um antibiótico.

 

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