Rastreio de uma biblioteca de genes por Hibridização com uma Sonda


A desnaturação do DNA pode ser provocada por aquecimento de uma solução aquosa de DNA a 100ºC ou por exposição a pH elevado (pH≥13). Contudo, a desnaturação do DNA não é irreversível: se mantidas a 65ºC por um período prolongado de tempo, as cadeias complementares de DNA voltam a formar duplas hélices por via de um processo designado por hibridização – permitindo assim a renaturação do DNA. Similarmente, a hibridização pode ocorrer entre quaisquer duas cadeias complementares de
ácidos nucleicos (DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA).

Este mecanismo é amplamente utilizado para detectar e caracterizar sequências específicas de nucleotídeos quer no RNA quer no DNA. No caso particular das bibliotecas de genes, as sondas permitem descobrir, por exemplo, se uma determinada sequência está presente ou mesmo caracterizar a sequência de um dado clone.

As moléculas de DNA de cadeia simples usadas para detectar sequências complementares designam-se por sondas; estas apresentam radioactividade ou marcadores químicos para facilitar a sua detecção e podem ter desde 15 até milhares de nucleotídeos. As reacções de hibridização com sondas de DNA são extremamente selectivas e sensíveis pois permitem detectar sequências complementares presentes em concentrações extremamente baixas (até uma molécula por célula).

As sondas são obtidas por polimerização de nucleotídeos (marcados radioactivamente e detectáveis por auto-radiografia; ou com um marcador químico que pode ser detectado pelo uso de um anticorpo específico) por acção de uma DNA polimerase.


As bibliotecas genómicas e de cDNA podem conter mais de um milhão de clones, no caso dos eucariotas. Procurar um clone específico tem que obedecer a um método preciso, caso contrário seria praticamente impossível encontrá-lo.

De forma geral existem duas formas para examinar (fazer o screening) uma biblioteca por forma a identificar os clones que “transportam” um determinado gene ou outra região de DNA de interesse:

1) detecção com uma sonda de oligonucleotídeos que se ligue ao clone de interesse

2) detecção baseada na expressão da proteína que o gene codifica.

 
No ensaio de hibridização esquematizado na
figura F6.1, uma sonda de cadeia simples é usada para detectar os fragmentos de DNA complementares à sonda, presentes numa mistura.

Inicialmente, a amostra de DNA é desnaturada originando cadeias simples que se ligam a um suporte sólido, geralmente filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon. A membrana é então incubada com uma solução contendo as sonda marcadas radioactivamente. Em condições apropriadas (pH aproximadamente neutro, 40-65ºC, 0.3-0.6 M NaCl) a sonda hibridiza com as cadeias complementares. As sondas em excesso, isto é, que não hibridizem, são extraídas e os híbridos são detectados por auto-radiografia.

▲ Figura F6.1: Ensaio de hibridização em membrana detecta complementaridade a uma sonda. Este ensaio pode ser usado para detectar DNA e RNA e a sonda marcada radioactivamente pode ser de DNA ou RNA. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 367.
  

A figura F6.2 consiste na aplicação deste procedimento ao caso duma biblioteca de cDNA. Neste caso, uma réplica da placa de Petri contendo os clones é reproduzida na superfície duma membrana de nitrocelulose. Usa-se então uma sonda marcada radioactivamente e específica para o DNA recombinante contendo o fragmento de interesse.

A hibridização com sondas radioactivas é usada para examinar bibliotecas de cDNA; quando é obtido um clone de cDNA que codifica uma dada proteína, o cDNA pode então ser marcado radioactivamente e usado como sonda dos clones de bibliotecas genómicas contendo fragmentos do gene correspondente.

▲ Figura F6.2: Bibliotecas de cDNA podem ser examinadas com sondas radioactivas para identificação do clone de interesse. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 368
 

A identificação de clones específicos pela técnica de hibridização em membrana está contudo dependente da disponibilidade de sondas complementares marcadas radioactivamente. Para que um oligonucleotídeo seja útil como sonda, deve ser suficientemente grande para que a sua sequência ocorra unicamente no clone de interesse e em nenhum dos outros clones. Habitualmente esta condição é satisfeita para oligonucleotídeos de cerca de 20 nucleotídeos. Estes oligonucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente e posteriormente marcados radioactivamente usando a cínase dos polinucleotídeos, a qual transfere fósforo radioactivo do ATP para a extremidade 5’ de cada nucleotídeo.

 
Tendo em conta que, se a sequência (ou parte dela) dos aminoácidos da proteína codificada pelo clone é conhecida, então pode construir-se uma
sonda complementar a uma pequena região do gene, baseando-se apenas no código genético. Contudo, como este código é degenerado (alguns aminoácidos são codificados por mais que um codão), uma sonda baseada na sequência de aminoácidos deve incluir todas as possíveis sequências de oligonucleotídeos que teoricamente podem codificar a sequência de interesse. Nesta mistura de oligonucleotídeos está presente a que hibridizará perfeitamente com o clone de interesse.



▲ Figura F6.3: Código genético.


▲ Figura F6.4: Desenho de sondas oligonucleotídicas baseadas na sequência proteica. Como a maioria dos aminoácidos são especificados por dois ou mais codons estes oligonucleotídeos são sintetizados usando-se uma mistura dos nucleotídeos das posições ambíguas. A sequência correcta estará representada entre os diversos oligonucleotídeos. Uma outra possibilidade é usar uma sonda tentativa cuja escolha é baseada na frequência de uso do codon na espécie em estudo. Neste caso emparelhamentos incompletos podem ocorrer. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php



Actualmente existe software que permite aos investigadores procurar de forma automatizada a sequência da proteína em estudo, com recurso às bases de dados genómicas já existentes. Se for encontrada, então bastará uma única sonda baseada na sequência genómica para que ocorra perfeita hibridização.

Paralelamente, a síntese das sondas está facilitada pela existência de instrumentos automáticos que os investigadores podem programar para construir a sonda que corresponda ás suas necessidades.

Alternativamente, as sondas podem ser preparadas por PCR, uma técnica usada para amplificação de sequências específicas de DNA.



Links de interesse:
Animação Hibridização (link externo / em inglês)
 

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