Electroforese

A electroforese é um método de separação de moléculas de DNA de acordo com o tamanho.

A pH neutro, as moléculas de DNA apresentam carga negativa; a electroforese consiste em aplicar um campo eléctrico à solução de DNA, fazendo com que estas moléculas migrem em direcção ao polo positivo. Assim, colocam-se os fragmentos de DNA em poços feitos numa matriz – gel de electroforese – tal que, quando for estabelecido o campo eléctrico, as moléculas de DNA em cada poço comecem a migrar por entre os poros da matriz; as moléculas mais pequenas migrarão portanto mais rapidamente que as maiores, que terão mais dificuldade em passar por entre os poro, formando bandas invisíveis..

Dependendo do tamanho dos fragmentos de DNA podem-se usar diferentes tipos de gel: gel de poliacrilamida (até 2000 nucleotídeos); gel de agarose (para moléculas com 200 até mais de 20000b).

Para permitir a visualização das bandas obtidas por electroforese é comum incubar-se o gel numa solução de brometo de etídeo (fluorescente). Esta molécula intercala-se entre os pares de bases e, quando estimulada por luz ultravioleta, emite fluorescência alaranjada, permitindo então localizar as diferentes bandas no gel.

 

▲ Figura F5.1: Electroforese. Moléculas de DNA de tamanhos diferentes podem ser separadas por electroforese. Moléculas menores movem-se mais rapidamente que moléculas maiores, tornando-se portanto separadas em bandas. O DNA é corado com brometo de etídeo uma molécula que fluoresce quando iluminada com luz Ultra Violeta. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

 

 
▲ Figura F5.2:  Separação de molécula de DNA de diferentes tamanhos por electroforese.  As bandas podem ser visualizadas por auto-radiografia (se os fragmentos estiverem marcados radioactivamente) ou por adição de uma molécula fluorescente que se ligue aos fragmentos de DNA (por exemplo, brometo de etídeo). Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 372.
 

No âmbito das bibliotecas de genes, a electroforese é particularmente útil pois a família de fragmentos gerados por digestão com a enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por electroforese em gel de agarose. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente.
Adicionalmente, para proceder à manipulação ou sequenciação do fragmento de DNA clonado pode também ser necessário recorrer à electroforese: por vezes, fragmentos de DNA clonados são separados do
vector e tratados com enzimas de restrição, obtendo-se subfragmentos (portanto mais pequenos), os quais, depois de separados por electroforese, podem ser ligados individualmente a vectores e clonados pelo procedimento normal. A subclonagem, tal como é conhecida, é importante no rearranjo de partes de genes em novas configurações mais úteis. Por exemplo, um investigador que queira modificar as condições em que um que é expresso pode usar a subclonagem para substituir o promotor normalmente associado ao gene clonado a outro segmento de DNA contendo um promotor diferente. A subclonagem pode ainda ser apropriada para obter fragmentos de DNA de tamanho adequado para determinar a sequência de nucleotídeos.



Links de interesse:
Electroforese (inglês / link externo) (inclui animação).
 

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