Blotting, detecção de fragmentos específicos de DNA e mRNA com sondas

Southern Blotting e Northern Blotting dizem respeito a dois métodos muito sensíveis para detecção duma sequência particular de DNA ou RNA, por combinação de separação por
electroforese, hibridização com sondas marcadas radioactivamente e auto-radiografia.

 

Southern Blotting

Técnica capaz de detectar um único fragmento de restrição específico numa mistura complexa de fragmentos produzidos pela clivagem de DNA com uma enzima de restrição, mesmo no caso da clivagem de todo o genoma, inclusivé o humano. Numa mistura tão complexa, muitos fragmentos poderão ter o mesmo tamanho e por isso migrarão juntos durante a electroforese. Apesar de nem todos os fragmentos serem separados completamente por electroforese - originando bandas que correspondem a fragmentos que codificam genes diferentes -, é no entanto possível identificar  um fragmento específico de qualquer banda por hibridização com uma sonda específica para esse fragmento.

Como as sondas não se difundem no gel original, os fragmentos de restrição presentes no gel são desnaturados e transferidos para um filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon por blotting (Figura F9.1).

O filtro é então incubado em condições de hibridização com uma sonda específica marcada radioactivamente, usualmente obtida a partir de um fragmento de restrição clonado. Desta forma, a sonda hibridiza com o fragmento de restrição que lhe é complementar e a sua localização no filtro é revelada por auto-radiografia.

Links de interesse:
Animação Southern Blotting
(link externo / em inglês)

 


▲ Figura F9.1: Detecção de fragmentos específicos de DNA numa mistura de fragmentos de restrição por Southern Blot.
  Uma técnica semelhante permite a detecção de mRNAs específicos numa mistura de mRNAs – Northern blotting. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 376.


Northern Blotting

Uma forma de caracterizar um gene clonado é determinar quando e onde no organismo esse gene é expresso.

O Northern blotting é um blotting dirigido para RNA: a amostra de RNA é desnaturada por forma a que estas moléculas se mantenham lineares. Os RNAs são separados por electroforese e transferidos para um filtro de nitrocelulose. O filtro é então exposto a sondas marcadas radioactivamente e complementares ao gene de interesse. Finalmente, o filtro é sujeito a auto-radiografia.
 

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