BIBLIOTECA DE GENES

Uma biblioteca de genes é uma colecção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de organismo, obtidos a partir da acção de endonucleases de restrição, ligados aos vectores apropriados e clonados após terem sido inseridos num hospedeiro. É suposto que uma biblioteca seja representativa de todos os genes do organismo, sendo muito útil quando se pretende isolar um gene específico. Assim, torna-se claro que quando se quer clonar um determinado gene ou o cDNA (DNA complementar) das mensagens por ele codificadas (mRNA) é necessário a construção de colecções de genes recombinantes. Se estes forem obtidos a partir do DNA genómico, sendo portadores de moléculas representantes de todo o genoma, constituem uma biblioteca genómica; uma biblioteca de cDNA é uma colecção de clones de DNA complementar derivados de toda a população de mensageiros da célula ou tecido de interesse. Uma biblioteca de genes pode ser uma colónia de bactérias (se for construída utilizando um plasmídeo ou um cosmídeo) ou placas de fagos (se o vector utilizado for um fago) com DNA recombinante. Esta inclui sequências de um conjunto muito grande, como o genoma inteiro de um organismo, sequências expressas de um tipo celular particular ou sequências presentes num fragmento de DNA.


▲ Figura A1: Bibliotecas genómicas. Biblioteca de plasmídeos (a) e biblioteca de fagos (b) Fonte: http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/c7.20.6.library.jpg


▲ Figura A2: Biblioteca de cDNA: de RNA ao cDNA. Fonte: http://www.mie.utoronto.ca/labs/lcdlab/biopic/fig/17.09.jpg

A complexidade dos organismos superiores (o genoma haplóide de mamífero é constituído por 3x109 pares de bases [pb] aproximadamente, o que faz com que se um determinado fragmento tiver 3000 pb, será apenas uma parte em 106 de uma preparação do DNA total) e a existência de uma espécie de mRNA rara (que pode compreender apenas uma parte em 105 ou 106 da fracção de RNA mensageiros de uma célula), obriga à obtenção de elevadas quantidades de genes. Deste modo, é garantida a presença na biblioteca de pelo menos uma versão de todas as sequências da população alvo. Para conseguir satisfazer esta condição, de modo a tornar a biblioteca útil, segue-se um procedimento que é semelhante nos dois tipos de bibliotecas referidos anteriormente e que engloba estratégias específicas na preparação do DNA alvo e na escolha do vector de clonagem. O DNA genómico e o cDNA previamente preparados inserem-se no vector escolhido, e após ser estabelecida a sua ligação são introduzidos no hospedeiro por infecção ou por transformação directa.


▲ Figura A3: Tipo de vector: Fago. Fonte: http://www.evergreen.edu/phage/images/homegraphic.gif


▲ Figura A4: Tipo de vector: Plasmídeo. Fonte: http://universe-review.ca/I10-71-plasmid.jpg


Existem diferenças importantes entre bibliotecas genómicas e de cDNA:

na biblioteca genómica pretende-se que os genes estejam representados na mesma proporção em que existem no organismo;

na de cDNA (obtido por cópia do mRNA), apenas estão presentes os genes que estão a ser expressos em determinado momento, na proporção dessa expressão. Assim, há variações entre bibliotecas de cDNA obtidas de células colocadas em condições ou estados de desenvolvimento diferentes, ou obtidas de diferentes tecidos de um mesmo organismo;

nas bibliotecas de eucariotas, uma diferença importante resulta das diferenças da estrutura genética ( DNA) e da estrutura dos seus transcritos (mRNA);

é muito mais difícil trabalhar com mRNA no laboratório do que com DNA.


▲ Figura A5: Bibliotecas genómicas versus Bibliotecas de cDNA. Neste exemplo, o gene A  não é frequentemente transcrito enquanto o B é frequentemente transcrito; ambos contêm intrões (a verde). Na biblioteca genómica, quer os intrões quer as sequências não transcritas de DNA (a rosa) são incluídos nos clones e a maioria contém, no máximo apenas uma curta porção da sequência codificante de um gene (vermelho). Nos clones de cDNA, os intrões (a amarelo) foram removidos devido ao splicing, durante a formação de mRNA (a azul), e assim cada clone apresenta uma sequência codificante contínua. Porque o gene B é mais frequentemente transcrito nas células a partir da qual a biblioteca foi feita, encontra-se portanto mais representado que o gene A. Por oposição, na biblioteca genómica, A e B estão teoricamente igualmente representados. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 504.

Das várias diferenças entre estas duas bibliotecas destacam-se algumas vantagens da biblioteca de cDNA:

não tem intrões, o que facilita a identificação e a caracterização dos genes, não havendo perigo de que peças de um determinado gene sejam recuperadas por outros genes;

o cDNA apenas representa os genes que estão a ser activamente utilizados pela célula, pois a RNA polimerase apenas transcreve genes activados;

a biblioteca de cDNA fique enriquecida para esse determinado gene, porque, em vez de termos uma ou duas cópias, temos tantas cópias quantos mRNAs a célula conseguir produzir para esse gene;

as bibliotecas de cDNA são mais fáceis de construir porque o cDNA, tal como o seu mRNA molde, é relativamente pequeno, portanto um cDNA inteiro pode ser inserido num único vector. Apesar disso, mantém-se a necessidade de construir uma biblioteca uma vez que as células produzem dezenas de milhares de mRNAs diferentes ao mesmo tempo, e portanto, depois de usarmos a trancríptase reversa, continuamos com uma grande quantidade de diferentes cDNAs.

Assim, muitos biólogos moleculares, quando procuram um novo gene, começam por analisar uma biblioteca de tecido ou organismo que suspeitam estar a usar activamente esse gene. Grande parte dos novos genes é descoberta assim.

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