BIBLIOTECA GENÓMICA

 

Uma biblioteca genómica deve conter várias cópias/clones representativos de cada fragmento de DNA para aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cópia única, ou seja, a maior parte dos genes codificantes de proteínas. A utilização de uma biblioteca é o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada porção de DNA. A separação da porção do DNA genómico que contem toda a unidade de transcrição com as regiões limitadoras onde estão localizados os elementos controladores da expressão desse gene, permite-nos obter informações acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas. O ponto ao qual se dá mais relevo na construção de uma biblioteca genómica é a obtenção aleatória de um elevado número de clones contendo fragmentos do genoma. Para garantir que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é necessário estimar o tamanho necessário da biblioteca através do tamanho do fragmento clonado e do tamanho do genoma. Para isso utiliza-se a seguinte fórmula, com base na distribuição de Poisson:

 

N=log (l-P) /log (l-l/n),

 

em que P é a probabilidade de se encontrar um fragmento único e n representa a razão entre o tamanho do genoma do organismo e o tamanho da inserção de DNA clonado. N (número de clones independentes que precisam de ser separados para se isolar uma sequência específica) é directamente proporcional à probabilidade e ao tamanho do genoma, em pares de bases (G) e inversamente proporcional ao tamanho médio dos clones, em pares de bases (I). Considera-se aceitável uma probabilidade acima de 95%. O seguinte exemplo ilustra a situação referida: partindo de uma biblioteca cujas inserções de DNA são de 20 kb, para isolar um gene humano de cópia única, torna-se necessário fazer o rastreio de cerca de um milhão de clones recombinantes (o tamanho total do genoma humano é aproximadamente 3x109. Deste modo, para termos 99% de probabilidade de isolar uma dada sequência presente numa única cópia de um gene de mamífero, temos que analisar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa como vector o fago λ:

 

N= ln (1-0.99) /ln [1- (2x104/3x109)] = 690.000
 

Assim, na construção destas bibliotecas o objectivo básico é procurar reduzir o número de clones necessários, aumentando o máximo possível o tamanho dos fragmentos de DNA clonados, e, utilizando vectores de clonagem baseados no fago λ, maximizar a eficiência da clonagem.

 

A construção de uma biblioteca genómica envolve basicamente os seguintes passos:

1º isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente é quebrado de modo a produzir fragmentos de tamanho compatível com o vector.

 

2º ligação desses fragmentos ao vector e introdução dos recombinantes obtidos nas células hospedeiras.


▲ Figura B1: Bibliotecas genómicas. Biblioteca de plasmídeos (a) e biblioteca de fagos (b) Fonte: http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/c7.20.6.library.jpg


PREPARAÇÃO DO DNA A SER INSERIDO
 

Para que não haja exclusão sistemática de nenhuma sequência, a representatividade de uma biblioteca genómica está muito dependente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados são gerados. O método que permite obter completa aleatoriedade na fragmentação do DNA é o fraccionamento mecânico. No entanto, este não é muito utilizado pois implica uma complicada manipulação para que os fragmentos assim obtidos possam ser inseridos no vector. Aplicando os cuidados necessários, é possível ultrapassar este obstáculo através de digestões parciais de DNA usando enzimas de restrição (Ver Técnicas: Enzimas de restrição). Este processo apresenta uma vantagem pois permite obter fragmentos com pontas coesivas, o que facilita a inserção directa do vector. Para ter a garantia que esta digestão atinge todo o genoma, são utilizadas enzimas de restrição que cortam frequentemente o DNA, não apresentando desvios de preferência de sítios. Com este fim, a enzima Sau3A I é utilizada frequentemente pois reconhece o sítio de 4 bases GATC, gerando fragmentos compatíveis com sítios de clonagem de vários fagos e cosmídeos (estatisticamente, uma sequência de 4 nucleótidos aparece, em média, cada 256 pares de bases). Há secções de DNA que possuem as sequências de conhecimento muito espaçadas, especialmente as de enzimas que cortam menos frequentemente, o que leva a uma maior probabilidade de gerar fragmentos de certas zonas de DNA, muito grandes para serem clonados e os genes aí existentes não estariam representados na biblioteca genómica. O corte parcial do DNA é feito em condições (relação enzima/DNA baixa ou tempo de digestão limitado) que maximizem a obtenção de fragmentos com um tamanho de cerca de 20 kb, um tamanho razoável para substituir o fragmento central do fago. Como resultado deste corte parcial são gerados fragmentos de DNA parcialmente sobrepostos. Estes precisam de ser tratados para evitar que fragmentos pequenos se liguem entre si, produzindo falsos recombinantes e clones artificiais que não correspondem à verdadeira estrutura genómica. Para impedir essas ligações pode-se tratar o DNA com fosfatase, ou efectuar um fraccionamento. Este último evita também que, fragmentos muito grandes que não permitem o crescimento do fago, se liguem aos braços deste, o que alteraria as relações entre as quantidades de DNA inserido e vector. Um método que é frequentemente utilizado é o fraccionamento por centrifugação em gradiente de sacarose, no qual a solução de DNA anteriormente digerida, é aquecida para que ocorra a dissociação de possíveis fragmentos agregados. Depois é aplicada sobre um gradiente de sacarose de alta salinidade. Este gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristáltica. A porção mais densa do gradiente que contem o DNA de maior molecular, é aspirada primeiro. Após a centrifugação, as fracções desse gradiente são colectadas e analisadas por electroforese num gel de agarose e as fracções contendo os fragmentos de DNA de tamanho apropriado são utilizadas para a ligação com o vector.


Figura B2: Método para fracionamento do DNA por centrifugação em gradiente de sacarose.
O gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba  peristáltica. A porção mais densa do gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, é aspirada primeiro.
Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

Garante-se assim, com todo este processo, a aleatoriedade dos fragmentos clonados, pelo que a probabilidade de uma dada sequência estar presente numa biblioteca genómica pode ser estudada estatisticamente - pelo método que foi acima referenciado
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Veja também "Vectores utilizados na construção de uma biblioteca genómica".

 

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