BIBLIOTECA DE cDNA

Uma biblioteca de cDNA é, muitas vezes, preferencialmente utilizada para se iniciar a clonagem de um gene. Isto, deve-se ao facto de, sendo o cDNA (DNA complementar) derivado do mRNA (RNA mensageiro), para uma proteína expressa na célula, obtêm-se bibliotecas em que a sua representação é significativamente maior do que em bibliotecas genómicas, o que auxilia o seu isolamento. Outra vantagem é poder deduzir-se facilmente a sequência da proteína pois o cDNA de eucariotas é uma cópia do mRNA processado. Finalmente, é bastante importante, para vários trabalhos de investigação, possuir um clone de DNA completo (com todas as sequências codificantes da proteína).

O cDNA é uma cópia da mensagem, não possuindo assim intrões e apresentando poucas sequências que não codificam proteínas. Esta ausência de intrões permite a directa transcrição e tradução dos cDNA de células eucarióticas superiores, em bactérias e outros microorganismos, o que permite a produção em massa de polipeptídeos importantes. A inexistência de intrões facilita igualmente a determinação directa da sequência da mensagem codificada e dedução subsequente da sequência de aminoácidos da proteína por ela codificada, o que se tem demonstrado extremamente útil na identificação de inúmeras proteínas que ainda não o tinham sido genética ou bioquimicamente.


▲ Figura C1: DNA genómico versus cDNA. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

A síntese, clonagem e isolamento de cDNAs específicos dá-se, resumidamente em 4 etapas:

*  Síntese in vitro de cDNAs de cadeia dupla partindo de mRNAs isolados do tecido de interesse, utilizando a enzima trancríptase reversa;

*  Preparação dos cDNAs para ligação com o vector escolhido;

*  Introdução dos cDNAs recombinantes numa célula hospedeira para serem replicados. Dar-se-á a amplificação dos recombinantes e, consoante o vector utilizado, a expressão das proteínas codificadas pelas mensagens que deram origem aos cDNAs;

* Identificação de clones específicos.



▲ Figura C2: Construção de uma biblioteca de cDNA.
1. Isolar mRNA das células; 2. Usar a transcríptase reversa para fazer cadeias de DNA complementares a cada mRNA. Usar a DNA polimerase para tornar o DNA de cadeia simples em DNA de cadeia dupla. 3. Inserir em plasmídeo e transformar em E. coli. Fonte: http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/sf16x5.jpg




SÍNTESE DE cDNAs DE CADEIA DUPLA

A elaboração de uma biblioteca de cDNA inicia-se com o isolamento do mRNA (substrato) total do tecido e com a selecção de parte de RNA poliadenilado que possui grande parte das mensagens contidas na célula. Este isolamento é efectuado por cromatografia de afinidade, em colunas contendo oligo-dT. A escolha deste fragmento de RNA é determinante para o processo restante, pois, se estiver degradado, afectará a representatividade das sequências na biblioteca. Após este passo, efectua-se a síntese dos cDNAs através de diversos processos, sendo o abaixo referido bastante comum:

 *  O mRNA é utilizado como molde para a síntese da primeira cadeia de cDNA, pela enzima trancríptase reversa. Esta enzima tem a capacidade de catalizar in vitro a polimerização de DNA a partir de RNA, necessitando de um primer com a extremidade 3’OH livre, para poder começar a síntese. Normalmente o primer utilizado é um pequeno oligonucleotídeo de desoxitimidinas (poli-dT) que vai hibridar na cauda de poli-A do mRNA. Resultam, desta reacção, moléculas híbridas de DNA/RNA que vão funcionar para a síntese da segunda cadeia de cDNA, como um complexo de moléculas molde (cDNA) e primers (mRNA).

 * Depois da síntese da cadeia de cDNA, a enzima RNase A vai remover parcialmente o mRNA, pois esta vai cortando pedaços do RNA da molécula híbrida RNA-DNA, formando nesta espaços vazios.

 * Os fragmentos não digeridos pela RNase A servem como primers para que a DNA polimerase substitua eficientemente o RNA por DNA, originando uma molécula de DNA de cadeia dupla.

 * Este DNA de cadeia dupla é tratado com T4 polimerase que possui actividade 3’-5’, sendo utilizada para remover possíveis nucleotídeos extras nas extremidades 3’ do cDNA.

 * Obtemos assim uma molécula de DNA de cadeia dupla que é a cópia exacta de uma determinada mensagem (mRNA).


▲ Figura C3: Síntese de cDNA de cadeia dupla.
mRNA é extraído de um dado tecido e cDNA é sintetizado a partir do mRNA, por acção catalítica da transcríptase reversa: Um oligonucleotídeo complementar à cauda poli-A da extremidade 3' do mRNA hibridiza com este, servindo como primer da transcríptase reversa, que copia então o RNA para uma cadeia complementar de DNA, formando um híbrido DNA/RNA. Tratando-o com RNase H, esta faz-lhe cortes e cria espaços na cadeia de RNA. A cadeia complementar de DNA é então copiada, formando-se cDNA de dupla cadeia por acção de uma DNA polimerase. O primer para esta reacção consiste no fragmento de mRNA original. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

Veja também "Vectores utilizados na construção de uma biblioteca de cDNA.

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