Sequenciação pelo método de Sanger


A caracterização completa de um fragmento de DNA clonado implica a determinação da sua sequência de nucleotídeos. Para este fim usa-se normalmente o método de Sanger, o qual permite determinar a sequência exacta de uma cadeia de DNA com até 500 nucleotídeos.

O método consiste na síntese de cadeias a partir do fragmento de DNA a ser sequenciado - cadeias essas que são marcadas radioactivamente numa extremidade e diferem entre si por um nucleotídeo. Por separação das cadeias truncadas através de electroforese, pode estabelecer-se a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA original.

A síntese das cadeias truncadas é conseguida pelo uso de ddNTPs (didesoxirribonucleosídeos trifosfatados), os quais, e ao contrário dos dNTPs (desoxirribonucleosídeos trifosfatados), não possuem o grupo 3’-OH. Assim, embora possam ser usados pela DNA polimerase na síntese de cadeias de DNA, não permitem a formação duma ligação fosfodiéster com outro nucleotídeo trifosfato, pelo que a sua incorporação na cadeia resulta numa cadeia truncada, nesse ponto.

 

Assim, inicialmente procede-se à desnaturação do fragmento de DNA de dupla cadeia, originando cadeias molde para a síntese in vitro de DNA. São necessários primers para que se inicie a reacção pela DNA polimerase. É também o primer que define qual a cadeia que é usada como molde. Usam-se ainda baixas concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs. Em cada reacção, um ddNTP é incorporado aleatoriamente na posição do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização (Figura F7.1a).

A inclusão de marcadores fluorescentes com diferentes cores para cada tipo de ddNTP permite a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência (Figura F7.1b). Por exemplo, todas as sequências truncadas que terminem com um ddGTP podem ter fluorescência de cor amarela, as terminadas com ddATP com cor vermelha, etc., independentemente dos seus tamanhos. Por electroforese das sequências truncadas em gel de poliacrilamida, separam-se as diferentes cadeias simples de DNA (as quais diferem entre si apenas por um nucleotídeo). Existem máquinas que fazem detecção da fluorescência e que podem distinguir os 4 marcadores fluorescentes dos outros tantos ddNTPs. A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde, ou seja, a sequência obtida não é a da cadeia molde, mas sim a da sua cadeia complementar. (Figura F7.1c).

 

▲ Figura F7.1: Clones de DNA podem ser sequenciados pelo método de Sanger, usando ddNTPs marcados com fluorescência. (a) Cadeia molde do DNA a ser sequenciado (a azul) hibridiza com primer de desoxirribonucleotídeo (a preto); o primer é alongado; neste exemplo, ddGTP (a amarelo) está presente; devido às baixas concentrações de ddGTP, a sua incorporação e consequente terminação da cadeia, ocorre numa dada posição da sequência, em 1% dos casos, originando cadeias truncadas. (b) Para obter a sequência completa da cadeia molde de DNA, são efectuadas 4 reacções, cada uma com um ddNTP diferente. O ddNTP que termina a cadeia truncada pode ser identificado pois cada ddNTP está marcado com moléculas fluorescentes de diferentes cores (indicadas pelas cores destacadas). (c) Numa máquina de sequenciação automática, os fragmentos truncados são submetidos a electroforese e a ordem de aparecimento de cada cor de fluorescência é registada, tal como evidenciado na figura. A sequência da cadeia molde pode então ser lida. N= nucleotídeos que não poderam ser atribuídos. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 373.
 


 
 
▲ Figura F7.2: Método de Sanger. (A) dNTPs e ddNTPs (b) DNA a ser sequenciado (a cinzento), DNA polimerase, primer de DNA (a laranja) para permitir a iniciação da reacção pela DNA polimerase, os 4 dNTPs: dATP [A], dGTP [D], dTTP [T], dCTP [C], a verde, um  ddATP [A], a vermelho.  (c) Após desnaturação, uma das cadeias de DNA é usada para sequenciação. Os ddNTPs aparecem a vermelho: ddATP [A], ddCTP [C], ddGTP [G], ddTTP [T]. Electroforese das cadeias truncadas. Leitura da sequência de nucleotídeos, a qual é idêntica à sequência a verde do DNA original em cadeia dupla (cadeia complementar à cadeia molde). Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 505.


Links de interesse:

Sequenciação DNA*             Download  seqdna.wmv (141KB), seqdna.mov (82KB)

Sanger Sequencing               (link externo / em inglês)

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