PCR - Polymerase Chain Reaction, Amplificação de DNA

 

Se as sequências de nucleotídeos das extremidades de uma dada região de DNA forem conhecidas, o fragmento flanqueado por essas sequências pode ser amplificado por PCR (polymerase chain reaction).

O PCR depende da capacidade de alternar entre a desnaturação do DNA de cadeia dupla e renaturação (anneal) de cadeias simples complementares, de forma controlada.

Um dos requisitos do PCR é o primer: um oligonucleotídeo (18-20 nucleotídeos) com uma sequência definida

Tal como demonstrado na figura F8.1, o PCR incia-se pela desnaturação - provocada pelo calor -de uma amostra de DNA nas suas cadeias constituintes. Seguidamente, duas cadeias oligonucleotídeas complementares às extremidades 3’ do segmento-alvo do DNA são adicionadas em excesso e a temperatura reduzida a 50-60ºC, hibridizando com as sequências complementares da amostra de DNA enquanto as cadeias longas do DNA se mantém separadas devido às suas concentrações reduzidas (é portanto bastante improvável que as duas cadeias hibridizem entre si). Os oligonucleotídeos servem então como primers na presença de dNTPs e duma DNA polimerase termoresistente, Taq polimerase. Esta enzima permanece activa mesmo a 95ºC e permite o alongamento até aos 72ºC. Quando a síntese termina, a mistura é aquecida a 95ºC de forma a desnaturar os recém-formados DNA de cadeia dupla. Quando a temperatura é diminuída de novo, outro ciclo de síntese ocorre, porque os primers continuam em excesso.

Ciclos repetidos de desnaturação e síntese rapidamente amplificam a sequência de interesse. Em cada ciclo, o número de cópias da sequência de interesse é duplicada; assim, a sequência de interesse sofre um aumento exponencial enquanto todas as outras sequências do DNA original não sofrem qualquer amplificação.

▲ Figura F8.1: Amplificação de sequências conhecidas por PCR. Para amplificar uma região específica de DNA, são necessários 2 primers complementares à sequência de aproximadamente 18 bases adjacentes à região de interesse (barra azul escura e azul clara) É necessário o DNA de dupla cadeia, primers (em excesso), dNTPs e Taq polimerase. Durante cada ciclo, ocorre primeiramente o aquecimento da mistura de forma a desnaturar o DNA e depois arrefecimento para permitir a ligação dos primers às sequências complementares adjacentes à região a ser amplificada; em seguida, a Taq polimerase faz o alongamento a partir da extremidade 3’, originando cadeias que se extendem no sentido 3’-5’ da cadeia molde. No terceiro ciclo, duas das moléculas de DNA de cadeia dupla obtidas consistem apenas na região de interesse. Em cada ciclo seguinte, o segmento-alvo, que se liga aos primers, é duplicado. Estes ciclos podem ser programados em máquinas (termocicladores), ocorrendo de forma automatizada. 20 ciclos amplificam a sequência alvo em 1milhão de vezes. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 374.
 

▲ Figura F8.2: Amplificação de DNA por PCR. (A) Desnaturação do DNA de cadeia dupla por elevação da temperatura (step1), diminuição da temperatura e consequente annealing dos primers (step2) e alongamento das cadeias pela Taq polimerase (step3). (B) Três ciclos iniciais de PCR; ao fim do 3ºciclo obtém-se 16 cadeias de DNA, 8 das quais correspondem à sequência de interesse (em caixa amarela). Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 509.

 

Em organismos cujo genoma foi (maioritariamente) sequenciado, a amplificação por PCR é frequentemente a forma mais simples de obter uma região de DNA específica e de interesse para clonagem.

Nesta aplicação do PCR, os dois primers são desenhados para hibridizar com sequências adjacentes à região genómica de interesse e incluir sequências reconhecidas pelas enzimas de restrição (Figura F8.3).

Após amplificação da sequência-alvo, e por clivagem com as enzimas de restrição apropriadas, obtém-se cadeias com extremidades coesivas que permitem a ligação eficiente do fragmento num plasmídeo (ou outro vector) tratado com a mesma enzima de restrição.

Os plasmídeos recombinantes resultantes, possuem o mesmo segmento de DNA genómico, e podem ser clonados em células de E. coli, por exemplo.

O PCR é portanto útil para isolar sequências de genes e posterior manipulação.

Figura F8.3: Amplificação por PCR de uma região-alvo do DNA genómico para efeitos de clonagem em momento posterior. Os primers são complementares a uma extremidade da sequência alvo e incluem a sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição (essa sequência não existe no seio da sequência da região-alvo. Neste exemplo, o primer 1 contem a sequência BamHI e o primer 2 a sequência HindIII. Notar que, por motivos de melhor perceptibilidade, em cada ciclo apenas uma das cadeias foi esquematicamente amplificada. Após amplificação, os segmentos-alvo foram tratados com as enzimas de restrição apropriadas, originando fragmentos com extremidades coesivas. Estes fragmentos podem então ser incorporados em plasmídeos tratados com as mesmas enzimas e clonados em E.coli pelo procedimento habitual. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 375.


Alternativamente, a técnica de PCR pode também servir a obtenção de clones de cDNA.

Assim, incialmente é necessário um primer que hibridize com o mRNA e uma transcríptase reversa que permita obter uma cadeia complementar de DNA a partir do molde de mRNA. Seguidamente, procede-se à desnaturação do complexo DNA/RNA e hibridiza-se a cadeia de DNA com um segundo primer, procedendo-se então à amplificação da sequência de interesse por PCR.

▲ Figura F8.4: PCR na obtenção de clones genómicos e de cDNA. (A) Para obter clones genómicos por PCR, procede-se inicialmente à purificação de DNA cromossomal das células; em seguida, adicionam-se primers ao DNA desnaturado; os primers ligam-se em zonas adjacentes à região de interesse; amplificação da sequência por PCR resulta na obtenção de porções de DNA na forma pura. (B) Para obter clones de cDNA por PCR, procede-se inicialmente à purificação de mRNA extraído das células. O primeiro primer é adicionado à população de mRNAs e, por acção da transcríptase reversa é obtido uma cadeia complementar de DNA. O segundo primer é então adicionado e a amplificação prossegue pelos diversos ciclos de PCR. NOTA: Usando PCR, para ambos os tipos de clonagem é necessário o conhecimento prévio de pelo menos parte da sequência de nucleotídeos da região a ser clonada. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 510.



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