Digestão com enzimas de restrição

 

Um gene não existe como uma entidade discreta na célula, mas sim como uma pequena região de uma molécula de DNA muito maior. Embora se possa efectuar a fragmentação do DNA por forças mecânicas, este processo é desajustado uma vez que fragmentos contendo um único gene seriam ainda ínfimos relativamente ao grande número de fragmentos obtidos.

Um grande objectivo da clonagem de DNA é obter essas pequenas regiões do DNA que constituem um determinado gene do organismo/tecido em questão. Adicionalmente, apenas moléculas de DNA relativamente pequenas podem ser clonadas nos vectores disponíveis. Assim, o DNA do organismo deve ser clivado em fragmentos de tamanho compatível com o vector em questão. Usam-se para este fim as denominadas enzimas de restrição.

As enzimas de restrição são endonucleases que podem ser purificadas a partir de bactérias e que reconhecem sequências específicas, com 4 a 8pb, clivando em seguida as duas cadeias de DNA nesse mesmo sítio; essas sequências designam-se por sítio de restrição e são normalmente curtas sequências palindrómicas, isto é, a sequência do sítio de restrição é a mesma em ambas as cadeias quando estas são “lidas” no sentido 5’ – 3’.

 

Os sítios de clivagem são portanto definidos pela sequência de nucleotídeos, e é portanto esta que define o tamanho dos fragmentos obtidos.

As diferentes enzimas de restrição apresentam especificidade para diferentes sequências o que permite escolher a(s) enzima(s) de restrição necessárias para clivar um fragmento de DNA com um determinado gene.
 


▲ Figura F1.1: Clivagem de DNA pela EcoRI. Esta enzima de restrição proveniente da E. coli cliva o DNA na sequência palindrómica GAATTC (6pb), originando fragmentos com extremidades designadas por “sticky” ends. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 361.


Muitas enzimas de restrição (EcoRI, HindIII, PstI...) produzem cortes em ziguezague nos sítios de restrição das cadeias de DNA, originando fragmentos que possuem uma “cauda” com uma só cadeia – “sticky” ends ou extremidades coesivas. As “caudas”, de ambos os lados, são complementares às de todos os outros fragmentos gerados pela mesma enzima de restrição (ou outra enzima de restrição que origine as mesmas extremidades coesivas). Assim, à temperatura adequada, estas regiões “single-stranded” podem portanto emparelhar com as dos outros fragmentos de DNA gerados pela mesma enzima de restrição.

Algumas enzimas de restrição, como a AluI e SmaI, clivam ambas as cadeias de DNA no mesmo ponto do sítio de restrição, originando extremidades “blunt” (abruptas), nas quais todos os nucleotídeos das extremidades do fragmento se encontram emparelhados.

 

        
▲ Figura F1.2: Extremidades abruptas (blunt) em (a) e extremidades coesivas (sticky ends) em (b).
Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php



▲ Figura F1.3: Esquema comparativo da acção de 4 enzimas de restrição. HpaI origina extremidades “blunt” enquanto as restantes originam extremidades coesivas. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 493.



Inúmeras enzimas de restrição foram purificadas de várias espécies de bactérias, a maioria das quais reconhece diferentes sítios de restrição, sendo amplamente comercializadas.
 

Enzimas de restrição

Origem 

Sequência de restrição 

Extremidade 

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens

-G-G-A-T-C-C-
-C-C-T-A-G-
G-

Sticky

       

EcoRI

Escherichia coli

-G-A-A-T-T-C-
-C-T-T-A-A-
G-

Sticky

 

 

 

HindIII

Haemophilus influenzae

-A-A-G-C-T-T-
-T-T-C-G-A-
A-

Sticky

 

 

 

 

KpnI

Klebsiella pneumonia

-G-G-T-A-C-C-
-C-
C-A-T-G-G-

Sticky

 

 

 

 

PstI

Providencia stuartii

-C-T-G-C-A-G-
-G-
A-C-G-T-C-

Sticky

 

 

 

SacI

Streptomyces achromogenes

-G-A-G-C-T-C-
-C-
T-C-G-A-G-

Sticky

 

 

 

SalI

Streptomyces albue

-G-T-C-G-A-C-
-C-A-G-C-T-G-

Sticky

 

 

 

SmaI

Serratia marcescens

-C-C-C-G-G-G-

Blunt

 

 

-G-G-G-C-C-C-

 

 

 

 

SphI

Streptomyces phaeochromogenes

-G-C-A-T-G-C-
-C-G-T-A-C-
G-

Sticky

 

 

 

 

XbaI

Xanthomonas badrii

-T-C-T-A-G-A-
 -A-G-A-T-C-
T-

Sticky

▲ Tabela F1.1:  Enzimas de restrição. Fonte: Lodish, H., et. al.1999. Molecular Cell Biology. 4th ed. New York. W.H. Freeman and Company. página 362.


Uma importante consequência da especificidade destas enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA. Portanto, cada enzima de restrição gera uma família única de fragmentos quando cliva uma molécula de DNA específica.



▲ Figura F1.4: Ligação entre fragmentos de DNA. Fragmentos com extremidades coesivas resultantes da acção duma mesma enzima de restrição (ou doutra que produza extremidades semelhantes) podem facilmente emparelhar, como ilustrado. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. página 493.

 

Retroceder        Avançar

......................................................................................................................................
 Voltar a Técnicas